血红蛋白的提取和分离实验操作

血红蛋白的提取和分离实验操作
〖实验过程〗
1、样品处理：
　　通过红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液等操作收集血红蛋白溶液。
（1）红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。分离时采取低速短时间离心，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
（2）血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。
（3）分离血红蛋白溶液：把搅拌好的混合液离心后，将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
（4）透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋放入300mL物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。
　　目的：将样品中分子量较小的杂质除去。
　　原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。
2、凝胶色谱的操作：
　　通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：
（1）凝胶色谱柱的制作。
（2）凝胶色谱柱的装填：
①材料：本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。
②方法：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有气泡存在；不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。
（3）样品的加入和洗脱
①准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
②加样：用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。
③加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶层内。
④洗脱：加入磷酸缓冲液，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。
3、蛋白质纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。
〖操作提示〗
1、红细胞的洗涤：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离效果。
2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，加速膨胀。
3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生这种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。
4、蛋白质的分离：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。

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